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幾丁質(zhì)酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-104

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

幾丁質(zhì)主要存在于蝦 、蟹 、 昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏賊的軟骨)， 以及真菌 類的細(xì)胞壁中 。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1. 14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害  的研究熱點。

測定原理：

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 N-乙酰氨基葡萄糖，進一步與對二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在 585nm 處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100ml×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體10ml×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體10ml×1 瓶，4℃保存；若出現(xiàn)結(jié)晶，可 80℃ 左右加熱溶解后使用）

試劑三：液體10ml×1 瓶，4℃保存；

試劑四：液體20ml×1 瓶，4℃避光保存；

自備儀器和用品：

天平、水浴鍋、離心機、可見分光光度計、1 ml 玻璃比色皿、蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（ g） ：提取液體積( ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1 ml 提 取液）進行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃離心 20min，取上清，置冰上待測。

2、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1 ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g，4℃,  離心 20min，取上清置于冰上待測。

3、培養(yǎng)液：直接測定。

測定操作表：

計算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.3088-0.003，R²=0.9995 

計算公式：

1、按照樣本重量計算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單 位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g 鮮重）=( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T 

=8.096×( ΔA +0.003）÷W

2、按照蛋白質(zhì)濃度計算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h mg prot）=( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T 

= 8.096×( ΔA +0.003）÷Cpr

3、按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃條件下，每 10⁴ 個細(xì)胞每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單 位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /10⁴ cell）= ( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量) 

=8.096×( ΔA +0.003）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單 位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h / ml）= ( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反總÷V 樣

=8.096×( ΔA +0.003）

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1 ml；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.4 ml；V 樣總：加入提取液體積， 1 ml； W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ ml

注意事項：

1、反應(yīng)結(jié)束后立即進行比色。

2、試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護措。