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β-木糖苷酶測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-117

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解 的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外， β-木糖苷酶還可以作為生物漂 白劑應(yīng)用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應(yīng)用價值。

測定原理

β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對硝基苯酚，對硝基苯酚在 405nm 處有特征 吸收峰，測定 405nm 光吸收增加速率，可計算β-木糖苷酶活性。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計、 1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三： 液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取

1、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃,離心 20min，取上清待測。

2、細(xì)菌、真菌： 按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時間 3min）； 然后 10000g，4℃,離心 10min， 取上清置于冰上待測。

3、液體：直接檢測。

測定操作表

β-木糖苷酶活性計算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=13.226x+0.0011 ，R²=0.9998；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL）， y 為吸光值 ΔA。

1、按蛋白濃度計算

酶活定義：45℃ , pH7.4 時每毫克蛋白 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基苯酚為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/mg prot）=(ΔA-0.0011)÷13.226×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

= 11.34×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：45℃ ,pH7.4 時每克樣品 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基苯酚為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA-0.0011)÷13.226×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×1000

= 11.34×(ΔA-0.0011)÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計算：

酶活定義：45℃ ,pH7.4 時每 10⁴個細(xì)胞 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基苯酚為一個酶活單位

β-木糖苷酶活性（nmol/min/10⁴cell）=(ΔA-0.0011) ÷ 13.226×V 反總÷V 樣×V 樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷T×1000

=11.34×(ΔA-0.0011) ÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個）

4、按液體體積計算

酶活定義：45℃ ,pH7.4 時每毫升液體 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基苯酚為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷ 13.226×V 反總÷V 樣÷T×1000 

= 11.34×(ΔA-0.0011)

V 樣總：加入提取液體積，1mL；V 反總：反應(yīng)總體積，0.6mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min ；1000:1μmol/mL=1000nmol/mL

ΔA 控制在 0.01-2 范圍內(nèi)，若ΔA 大于 2，可適當(dāng)減小樣本量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為： 0.01μmol/mL-0.5μmol/mL。