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果膠裂解酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-319

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

果膠裂解酶（EC4.2.2.10 ）是果膠酶的重要組成部分，是一種能降解植物細胞壁，導(dǎo)致植物  組織軟化甚至死亡的解聚酶，來源比較廣泛，主要來源于微生物，可用于果汁、果酒的澄清， 提高水果出汁率，植物病毒的純化，紙漿的漂白和紡織品的生物精煉，在減少環(huán)境污染和降  低能源消耗方面具有潛在的應(yīng)用價值。

測定原理

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4 糖苷鍵，生成在還原端 C4 和 C5 之間位置具有不飽和鍵的 不飽和寡聚半乳糖醛酸，在 235nm 處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機、紫外分光光度計、 1 mL 石英比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。 10000g  ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌、真菌：  按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議

500 萬細胞加入 1mL 提取液）， 冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時間 3min）； 然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。

3、培養(yǎng)液：直接測定。

測定操作表

酶活性計算公式

1、組織中 PL 活性

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義： 在 40℃, pH5.5 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL 活性（nmol/min/mg prot）= A÷ (ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 64.1×A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義： 在 40℃, pH5.5 條件下，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL 活性（nmol/min/g  鮮重）= A÷ (ε×d）×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 64.1×A÷W

2、細胞 PL 活性

酶活性定義：在 40℃, pH5.5 條件下，每 10⁴ 個細胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL 活性（nmol/min/10⁴cell）= A÷ (ε×d）×V 反總÷（V 樣×細胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 64.1×A÷細胞數(shù)量

3、培養(yǎng)液 PL 活性

酶活性定義： 在 40℃, pH5.5 條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL 活性（nmol/min/mL）= A÷ (ε×d）×V 反總÷V 樣÷T 

= 64.1×A

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)： 5200L/mol/cm； d：比色皿光徑， 1cm；V 反總：反應(yīng)  總體積，1mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr： 樣本蛋白濃度，mg/mL；W ，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min