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濾紙酶（FPA）試劑盒說(shuō)明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-119

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4 葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，研究濾紙酶活 力對(duì)纖維素酶的研究具有非常重要的意義。

測(cè)定原理：

濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與 3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在 540nm 處有最大光吸 收 ，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測(cè)定計(jì)算得濾紙酶的活力。

試劑組成和配制

試劑一: 液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二: 液體 40mL×1 瓶，4℃保存。

濾紙條: 50mg×50 條。

自備儀器和用品：

天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 ml 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1、組織：按照質(zhì)量（g） ：蒸餾水體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g，加入 1ml 蒸餾水）加入 蒸餾水，冰浴勻漿后于 4℃,   12000rpm 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（ 104 個(gè)） ：蒸餾水體積（ml） 為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 4℃,  12000rpm 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1、根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和 Ep 管，每支 Ep 管中放入一個(gè)卷狀濾紙條(注意要 放入底部)，作為底物。

2、對(duì)照管：取 200μl 滅活的酶液，加入 500μl 試劑一 ，充分混勻，再加入放有濾紙條的 Ep 管中，標(biāo)注為對(duì)照管。

3、測(cè)定管：取 200μl 酶液，加入 500μl 試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的 Ep 管中，標(biāo)注為測(cè)定管。

4、對(duì)照管和測(cè)定管同時(shí)置于 50℃水浴鍋中反應(yīng) 30min。

5、加入 800μl 試劑二，沸水浴 5min，自來(lái)水冷卻后取 1ml 于 1ml 玻璃比色皿中測(cè)定 540nm 處吸光值，分 別記為 A 對(duì)照管和 A 測(cè)定管。

酶活性計(jì)算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.2805x - 0.0255，R² = 0.9991

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在 50℃,pH4.6 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/mg prot）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）÷ Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在 50℃, pH4.6 條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/g 鮮重）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）÷ W

3、按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在 50℃, pH4.6 條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/ml）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷V 樣÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）

4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在 50℃, pH4.6 條件下，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/10⁴cell）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷V 樣總）÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

V 反總：反應(yīng)總體積， 1.5ml，V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2ml；V 樣總：加入提取液體積， 1ml； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

1、用干凈的鑷子取出濾紙條，帶手套卷成卷放入 Ep 管底部。

2、樣本滅活時(shí)保證同一批樣本處理時(shí)間一致，建議沸水浴十分鐘。

3、批量樣本測(cè)定之前先做 1-2 個(gè)樣本的預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值超過(guò) 1.2 ，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

4、顯色后取檢測(cè)液時(shí)注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物，影響測(cè)定結(jié)果。