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貨號(hào)：LE-1-118

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又稱 γ-淀粉酶，是一種外切型糖苷酶，它從淀粉的 非還原性末端水解 α-1,4 糖苷鍵和 α-1,6 糖苷鍵，將淀粉完全水解為葡萄糖，因此廣泛的應(yīng) 用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸，甘油，淀粉糖等工業(yè)中，是我國重要的工業(yè)酶 制劑之一。

測(cè)定原理

糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，與 3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色化合物，在 540nm 處 有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與葡萄糖的量成正比，可測(cè)定計(jì)算得糖化酶的 活力。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。（若出現(xiàn)沉淀，可以 90℃加熱 5 分鐘溶解后使用）

試劑二：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃, 10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）；然后 4℃, 10000g 離心 10min ，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作

酶活性計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.2164x - 0.0182 ，R² = 0.9992

1、按照蛋白含量計(jì)算

酶活性定義：在 40℃, pH4.6 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/mg prot）= (△A+0.0182）÷ 0.2164×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T 

= 2.54×(△A+0.0182）÷ Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在 40℃, pH4.6 條件下，每克組織每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/g  鮮重）= (△A+0.0182）÷ 0.2164×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T 

= 2.54×(△A+0.0182）÷ W

3、按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：在 40℃, pH4.6 條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1mg 葡萄 糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/mL）=  (△A+0.0182）÷ 0.2164×V 反總÷V 樣÷T

= 2.54×(△A+0.0182）

4、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在 40℃, pH4.6 條件下，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/10⁴ cell）= (△A+0.0182）÷ 0.2164×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷V 樣總）÷T

= 2.54×(△A+0.0182）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）

V 反總：反應(yīng)總體積，0.55mL ，V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入 提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)

1、滅活樣本的制備建議將樣本放在沸水浴中煮沸 10min ，以將酶徹底滅活。

2、測(cè)定之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值較高，請(qǐng)將樣品用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y(cè)定，并在 計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。