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葡萄糖脫氫酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-105

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

GCDH（EC 1.1.1.47 ）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高  等動物的肝臟和弱氧化醋桿菌中。在低聚果糖生產(chǎn)中使用GCDH，不僅能去除低聚果糖中的 葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸與鈣離子結(jié)合生成的葡萄糖酸鈣是一種理 想的補鈣制劑。因而，GCDH已成為制備高含量低聚果糖的理想用酶。

測定原理：

GCDH 催化 D-葡萄糖和 NAD 生成 D-葡萄糖酸和 NADH ，在 340nm 下測定 NADH 上升速 率，即可反映 GCDH 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 47.5 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、組織的前處理： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10  的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞 數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制： 臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用； 用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、將工作液置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。

4、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始 吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2 ，計算 ΔA=A2-A1。

GCDH 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=3215×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=3215×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1 × 10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³  L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時間， 1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。