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果糖 1,6-二磷酸醛縮酶（FDA）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-238

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

植物葉綠體中果糖 1,6-二磷酸醛縮酶是光合作用中參與 calvin 循環(huán)的重要酶 。催化果糖 1,6-二磷酸和 景天庚酮糖 1,7-二磷酸的合成反應(yīng)，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng)。

測(cè)定原理：

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和 α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化 NADH 和磷酸二羥丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油，340nm 處吸光值的變化可 反映果糖 1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低。

試劑組成和配制

提取液一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體×1瓶 ，4℃避光保存；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

天平 、低溫離心機(jī) 、震蕩儀 、研缽 、紫外分光光度計(jì) 、 1 ml 石英比色皿。

酶液提?。?/span>

1、總 FDA 酶提?。?/span>建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1ml 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s， 間歇 7s，總時(shí)間 1min） ，然后 4℃,   8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

2、胞漿和葉綠體 FDA 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱取 約 0. 1g 樣本，加入 1ml 提取液一） ，冰浴勻漿后于 4℃,   200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃,   8000g 離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 FDA 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min） ，然后 4℃,   8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中 FDA 酶活性。

建議測(cè)定總 FDA 酶活性 ，按照步驟①提取粗酶液 ，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 FDA ，則按照步驟 ② 提取粗酶液。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、取 1ml 石英比色皿，依次加入 500μl 試劑一 ， 100μl 試劑二，100μl 試劑三， 100μl 試劑四， 100μl 試劑 五 ，100μl 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A1-A2

計(jì)算公式：

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

FDA（nmol/min /mg prot）= ΔA÷(ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min /g  鮮重）= ΔA÷(ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=321.54×ΔA÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷(ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總)÷T

= 321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

FDA（nmol/min /ml）= ΔA÷(ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0. 1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃 度 ，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g