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焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-246

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP ，EC2.7. 1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組 織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝中起重要作 用。

測定原理

PFP 催化 6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為 1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?nbsp;3-磷酸甘油醛，再由3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 催化生成 3-磷酸甘油酸、NAD 和磷酸， 340nm 處的吸光度變化反映了 PFP 的活性的高低。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 mL 石英比色皿。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體 0.5mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑五：液體 0.5mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g ，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃ , 10000g 離心 10min ，取上清置冰上待測。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~ 1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）；然后 4℃ , 10000g 離心 10min ，取上清置冰上待測。

3、液體：直接檢測。

測定操作

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min ，調(diào)節(jié)波長至 340nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、取 1mL 石英比色皿，依次加入 580μL 試劑一，100μL 試劑二，100μL 試劑三，10μL 試 劑四，10μL 試劑五，100μL 試劑六，100μL 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的 吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2 ，△A=A1-A2

計(jì)算公式

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

PFP（nmol/min/mg prot）=ΔA÷ (ε×d） ×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /g  鮮重）=ΔA÷ (ε×d） ×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=321.54×ΔA÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷ (ε×d） ×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總)÷T 

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /mL）=ΔA÷ (ε×d） ×V 反總÷V 樣÷T

=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T ：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g