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貨號(hào)：LE-1-240

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶是光合作用中參與calvin 循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和 磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化，磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并在其中逐 步轉(zhuǎn)化為蔗糖。

測(cè)定原理

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與 NAD 在 3-磷酸甘油 醛脫氫酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和 NADH ，340nm 處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異 構(gòu)酶的活性的高低。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計(jì)、1 mL 石英比色皿。

試劑組成和配制

提取液一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

酶液提取

① 總TPI 酶提?。?/span>建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴， 200W ，破碎 3s ，間歇 7s ，總時(shí)間 1min），然后 4℃ , 8000g 離心 10min ，取上清測(cè)定。

② 胞漿和葉綠體 TPI 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5～10 的比 例（建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃ , 200g 離心 5min ，棄 沉淀，取上清在4℃ , 8000g 離心 10min ，取上清用于測(cè)定胞漿 TPI 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s ，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后4℃ , 8000g 離心 10min ，取上清測(cè)定葉綠體中 TPI 酶活性。

建議測(cè)定總TPI 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 TPI， 則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定操作

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min ，調(diào)節(jié)波長至 340nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、取 1mL 石英比色皿，依次加入 600μL 試劑一，100μL 試劑二，100μL 試劑三，100μL 試 劑四，100μL 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2， △A=A2-A1

計(jì)算公式

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷(ε×d） ×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min /g  鮮重）= ΔA÷(ε×d） ×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色 皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T ：反應(yīng)時(shí) 間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g