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果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)/果糖-1,6-二磷酸酯酶試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-247

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

果糖-1,6 二磷酸酶又稱果糖 1,6 二磷酸酯酶，催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和無 機(jī)磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。

測(cè)定原理

FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和無機(jī)磷，在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異 構(gòu)酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm下測(cè)定 NADPH 增加速率， 即可計(jì)算 FBP 活性。

需自備的儀器和用品

分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

提取液一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入 40mL 試劑四充分溶解待用，用不完的試劑4℃ 保存；

試劑二： 液體 18μL×1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 2.5mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入 2.5mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃ 保存；

試劑四： 液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

樣本的前處理

1、總 FBP 酶提取： 建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰 浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃ ,  8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

2、胞漿和葉綠體 FBP 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10 的比 例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于4℃ ,  200g 離心 5min，棄 沉淀，取上清在 4℃ ,  8000g 離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 FBP 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃ ,  8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中 FBP 酶活性。

建議測(cè)定總 FBP 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 FBP，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。

3、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí)， 在 340 nm波長(zhǎng)下記錄反應(yīng) 1min 后吸光度 A1 和反應(yīng) 6min 后的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

FBP 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷(ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=321.5×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FBP（nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷(ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=321.5×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³  L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1  mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。