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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-349

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

PEPCK（EC 4.1.1.32 ）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸 ，是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶。

測定原理：

PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO₂ ，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺ ，在 340nm 下測定 NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 45 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 41μL×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑四的配制：臨用前加入 2.5mL 蒸餾水充分溶解待用； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、將工作液和試劑四置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 5 分鐘。

5、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑四和900μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和  1min 后的吸光值 A2 ，計算 ΔA=A1-A2。

注意：

在該試劑盒中，若 ΔA 大于 0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使 ΔA 小 于 0.1 可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

PEPCK 活性計算：

1、血清（漿）PEPCK 活力計算

單位定義 ：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 

PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=3215×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPCK 活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=3215×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=3215×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時間， 1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總 數(shù)，500 萬。