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丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-351

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase ，PC ，EC 6.4.1. 1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO₂ 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，是糖異生過(guò)程的第一個(gè)限速酶，在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。

測(cè)定原理：

PC 催化丙酮酸、ATP、CO₂ 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi ，蘋(píng)果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和 NADH 生成蘋(píng)果酸和 NAD⁺ ，在 340nm 下測(cè)定 NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 47 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 32.8μL×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 提取液 ，用冰浴勻漿器或研缽勻 漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 PC（此步可選做）。

5、在步驟 ④ 的沉淀中加入 1mL 提取液 ，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）， 用于線粒體 PC 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制： 臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 5 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑四的配制：在試劑四瓶中加入 2.5mL 蒸餾水充分溶解待用； 用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑四和900μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

注意：

在該試劑盒中，若 ΔA 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使 ΔA 小于 0.5 可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

PC 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1608×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min /g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬(wàn)。