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錳過氧化物酶試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-385

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

錳過氧化物酶（EC1. 11. 1. 13）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，主要存在于擔(dān)子菌中，屬于木質(zhì)素降解酶系，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物、 DTT ，多環(huán)芳烴等。

測定原理

錳過氧化物酶在 Mn²⁺ 存在的條件下，將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在 465nm有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

試劑一：液體 75mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 11mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g ，加入 1mL 試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃ , 10000g 離心 10min ，取上清置于冰上待測。

2、細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~ 1000： 1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時間 3min）；然后 4℃ , 10000g 離心 10min ，取上清置于冰上待測。

3、培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。

測定操作

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 465nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、測定前將試劑一、二、三、四在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。

3、樣本測定表

在 1 mL 玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄 465nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 2min30s 后的吸光值 A2 。計算ΔA ＝A2-A1。

注意：

若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液，在 37℃（哺 乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上，測定時加入 100μL 樣本和 900μL 混合液測定。

酶活計算公式

1、按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V 反總÷ (ε×d） ×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=413×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/g  鮮重）= [ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹] ÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 413×ΔA÷W

3、按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義：每 10⁴ 個細胞每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d） ×10⁹] ÷（V 樣×細胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 413×ΔA÷細胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個酶活力單位。 

MnP 活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反總÷ (ε×d） ×10⁹]÷V 樣÷T

= 413×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積， 1×10-3L；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋 白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2min