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組織無機(jī)磷含量測定試劑盒說明書(分光光度法) 

貨號：LE-1-257

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

無機(jī)磷主要指磷酸根，參與生物體內(nèi)多種代謝，包括能量代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和 脫磷酸化等等，此外促進(jìn)碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)。

測定原理：

鉬藍(lán)與磷酸根生成 660nm 有特征吸收峰的物質(zhì)，通過測定 660nm 光吸收可計(jì)算無機(jī)磷含量。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存 。臨用前配制，加入 20 mL 蒸餾水，充分溶解后加入試劑 二（全部），混勻。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支， 4℃保存。

無機(jī)磷提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。 10000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、打開水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度到 40℃。

3、空白管：取 EP 管，依次加入 500μL 蒸餾水 ，500μL 試劑三，混勻后置于 40℃水浴保溫 10min，室溫冷卻 10 min 后于 660 nm測定吸光度，記為 A 空白管。

4、標(biāo)準(zhǔn)管：取 EP 管，依次加入 50μL 標(biāo)準(zhǔn)液 ，450μL 蒸餾水 ，500μL 試劑三，混勻后置于 40℃水浴保溫 10min，室溫冷卻 10 min 后于 660 nm測定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

5、測定管：取 EP 管，依次加入 50μL 上清液， 450μL 蒸餾水 ，500μL 試劑三，混勻后置于 40℃水浴保溫 10min，室溫冷卻 10 min 后于 660 nm測定吸光度，記為 A 測定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

組織無機(jī)磷含量計(jì)算公式：

1、按照蛋白含量計(jì)算

無機(jī)磷含量(μmol/mg prot)= [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總 ÷Cpr

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

無機(jī)磷含量(μmol/g )= [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W 

= 1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液： 1mmol/L；V 總：上清液總體積， 1mL=0.001 L；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL； W：樣品質(zhì)量， g。

注意事項(xiàng)：

1、試劑三需臨用前配制，并且當(dāng)天使用完畢。

2、40min 內(nèi)完成比色。

3、最低檢出限為 10 μmol/L。