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NADPH-細(xì)胞色素 C 還原酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-366

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

細(xì)胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR 作為 P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生。

測(cè)定原理:

NCR 催化 NADPH 還原氧化型細(xì)胞色素 c 生成還原型細(xì)胞色素 c，還原型細(xì)胞色素 c 在 550nm 處有特征吸收峰;通過(guò)測(cè)定 550nm 吸光度的增加速率，來(lái)計(jì)算 NCR 活性。

自備儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、 1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前配制，加 2.6 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前配制，加 550 μL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約 0.5g 組織，加入 4℃預(yù)冷的 1 mL 試劑一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃離心 30min ，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃, 100 000g，離心 60min ，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1 mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min ，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 mL ，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

測(cè)定操作:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二在 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 蒸餾水、900μL 試劑二、50μL 試劑三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分別記 為 A1 和 A2，△A 空白管=A2-A1。

4.  測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 粗酶液、900μL 試劑二、50μL 試劑三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分別記 為 A3 和 A4，△A 測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。

計(jì)算公式:

1、按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義: 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR 酶活性(nmol/min/mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷( Cpr×V 樣)  ÷T 

= 529×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義: 37℃中，每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR 酶活性(nmol/min/g 鮮重)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷( W×V 樣÷V 樣總)÷ T

= 265×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε: 還原型細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)， 19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm; d:  比色皿光徑，  1cm; V 反總: 反應(yīng)體系總體積， 1010μL=0.00101L; Cpr: 上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL， 需要另外測(cè)定; V 樣: 加入反應(yīng)體系中上清液體積，50μL=0.05mL; V 樣總: 加入提取液體積， 0.5mL; W: 樣本質(zhì)量，g; T: 反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng):

試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的 4℃ 可保存兩天。