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氨基比林-N-脫甲基酶（AND）活性測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-367

正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

細胞色素 P450 酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物,具有重要作用的酶系。AND 作為 P450 酶系的重要一員，相當于 CYP3A4 亞型,  與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理:

AND 催化氨基比林釋放甲醛，通過 Nash 比色法測定甲醛含量，即可計算出 AND 活性。

自備儀器和用品:

可見分光光度計、普通離心機、超速離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL 玻璃比色皿、蒸餾水、無水乙醇和冰。

試劑組成和配制:

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50mL 蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶( 棕色瓶)，4℃避光保存。臨用前加入 2.6 mL 無水乙醇，充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 2.6 mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水 10mL 充分溶解。

試劑六：液體×1瓶，室溫保存。

試劑七：液體×1瓶，4℃保存。

標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取 1.5 mL EP 管, 加入 10μl 標準液, 加990μl 蒸餾水，混勻即為 0.05 mmol/L 標準甲醛溶液, 4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì): 稱約 0.5g 組織, 加入 1 mL 試劑一，冰上充分研磨, 10 000g 4℃離心 30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2、粗制微粒體: 4℃,100 000g，離心 60min , 棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì): 向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解, 100 000g 離心 30min , 棄上清液。

4、最終微粒體: 向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。

AND 活性測定操作:

1、分光光度計預熱 30 min,  調(diào)節(jié)波長到 412 nm, 蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二置于 37℃水浴中預熱 30min。

3、對照管: 取 1 支 EP 管, 加入 50μL 粗酶液, 850μL 試劑二, 50μL 試劑三, 50μL 蒸餾水, 混勻后置于 37℃水浴保溫 30min; 立即加入 175μL 試劑五, 混勻后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175μL 試劑六,  混勻后室溫靜置 5min; 室溫 8000rpm 離心 5min; 取新的 EP 管, 加 入 500μL 上清液, 500μL 試劑七, 混勻后 60℃水浴 10min, 然后取出,用冷水冷卻 5min , 于 412nm 測定光吸收, 記為 A 對照管。

4、測定管: 取 1 支 EP 管, 加入 50μL 粗酶液, 850μL 試劑二, 50μL 試劑三, 50μL 試劑四, 混勻后置于 37℃水浴保溫 30min; 立即加入 175μL 試劑五, 混勻后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175μL 試劑六,  混勻后室溫靜置 5min; 室溫 8000rpm 離心 5min;  取 1 支新 EP 管,   加入 500μL 上清液, 500μL 試劑七, 混勻后 60℃水浴 10min, 然后取出, 用冷水冷卻 5min , 于 412nm 測定光吸收, 記為 A 測定管。

5、標準管: 取 1 支 EP 管,加入 500μL 標準品, 500μL 試劑七, 混勻后 60℃水浴 10min , 然后取出,用冷水冷卻 5min,于 412nm 測定光吸收,記為 A 標準管。

注意: 每個樣品都需要做對照管。

AND 活性計算:

1、按照蛋白濃度計算:

活性單位定義: 37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

AND 活性(nmol/min/mg prot)= C 標準品×V 標準品×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標準管×稀 釋倍數(shù)÷( Cpr×V 樣) ÷T

= 45×( A 測定管 -A 空白管)÷A 標準管÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算:

活性單位定義: 37℃中每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

AND 活性(nmol/min/g  鮮重)= C 標準品×V 標準品×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標準管×稀 釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T

= 45×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標準管÷W

C 標準品: 0.05 mmol/L=50μmol/L; V 標準品: 500μL=0.0005 L; 稀釋倍數(shù): V 反總÷V 上清 液= ( 50+850 +50+50+175+175) ÷500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白質(zhì)濃度 mg/mL, 需要另外測定, 建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒; V 樣: 加入粗酶液體積, 50μL=0.05mL; W: 樣本質(zhì)量, g  ; T:  反應(yīng)時間, 30min。

注意事項:

1、粗酶液需在當日完成測定,如需保存,則向粗酶液提取步驟 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的 甘油,分裝后, -80℃保存;

2、試劑三和試劑四需臨用前配制,如當天沒有用完, 4℃避光保存,可用 1 周;

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定,建議用 BCA 法測蛋白含量。