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貨號：LE-1-368

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

細胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和  毒物的代謝。AH 在 P450 酶系中相當于 CYP2E1 亞型，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多 種前致癌物和前毒物的活化過程。

測定原理：

AH 催化苯胺羥化后產(chǎn)生的 4-氨基酚，進一步轉變?yōu)榉?吲哚復合物，在 630nm 處有特征吸收峰；通 過測定 630nm 吸光度增加速率，來計算AH 活性。

試劑盒的組成和配置：

試劑一：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 50ml 蒸餾水，充分溶解。 

試劑二：液體×1 瓶 ，4℃保存 。

試劑三：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 26ml 蒸餾水，充分溶解。 

試劑四：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 13ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：液體×1 瓶 ，4℃保存 。

試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑） ，4℃避光保存 。臨用前加入 26ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑七：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 26ml 蒸餾水充分溶解。

標準液：液體×1 瓶 ，10μmol/L，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計 、普通離心機 、超速離心機 、可調式移液槍 、 1ml 玻璃比色皿 、雙蒸水和冰。

粗酶液提取：

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一 ，冰上充分研磨，10 000g 4℃, 離心 30min，取上清液，轉移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：  100 000g 4℃,   離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄 上清液。

4、最終微粒體： 向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。

測定操作：

1、分光光度計預熱 30 min，調節(jié)波長到 630 nm，蒸餾水調零。

2、試劑三置于 37℃水浴中預熱 30min。

3、試劑五置于冰浴預冷 30min。

4、標準管：取 1.5ml EP 管，加入 500μl  標準液，500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min， 于 630 nm 測定光吸收，記為 A 標準管。

5、對照管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 試劑三，250μl 蒸餾水，混勻后 37℃水浴中保 溫 30min；再加入 500μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃,  離心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測定光吸 收 ，記為 A 對照管。

6、測定管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 試劑三，250μl 試劑四，混勻后 37℃水浴中保 溫 30min；再加入 500μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃,   離心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測定光吸 收 ，記為 A 測定管。

AH 活性計算公式：

1、按照蛋白濃度計算:

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr

2、按照樣本質量計算:

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g  鮮重)= C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T 

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W

C 標準品： 10μmol/L；V 標準品：500μl=0.0005L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=1500μl÷500μl=3；Cpr： 粗酶液蛋白質濃度，mg/ml，需要另外測定，建議使用本公司 BCA蛋白質含量測定試劑盒；V 樣：加入反 應體系中粗酶液體積，250μl=0.25ml；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min。