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細(xì)胞色素 b5( Cytochrome b5)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-370

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細(xì)胞色素 P450 和細(xì)胞色素 b5 是 P450 酶系的兩個(gè)血紅素蛋白，其比值的變化與 P450 代謝活性密切相關(guān)。

測(cè)定原理:

氧化型細(xì)胞色素 b5 經(jīng)連二亞硫酸鈉還原后，在 424nm 處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定 424nm 和 490nm 處吸光值的差異，即可計(jì)算出細(xì)胞色素 b5 的含量。

自備儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、 1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存;

工作液配制: 臨用前配制，戴一次性手套，小心打開(kāi)試劑三瓶蓋，加試劑二 50  mL 充分溶 解，4℃避光可保存 1 周。

樣品中細(xì)胞色素 b5 提取:

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì): 稱約 0.5g 組織，加入 1mL 試劑一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃離心 30min ，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體: 100 000g，4℃離心 60min ，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì): 向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min ，棄上清液。

4、待測(cè)液: 向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解， 即待測(cè)液，該待測(cè) 液需當(dāng)天測(cè)定。

細(xì)胞色素 b5 含量測(cè)定操作:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min。

2、工作液置于 25℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3、空白管:  取 1mL 玻璃比色皿，加入 50  μ L 蒸餾水， 1000μ L 工作液，室溫靜置 2 min， 424nm 和490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為 A 空白管 1 ，490nm 處吸光值記為 A 空白管 2 。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4、測(cè)定管:  取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μ L 待測(cè)液， 1000μ L 工作液，室溫靜置 2 min ， 424nm 和490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為 A 測(cè)定管 1 ，490nm 處吸光值記為 A 測(cè)定 管 2 。△A 測(cè)定管= A 測(cè)定管 1- A 測(cè)定管 2。

注意:只需要做一個(gè)空白管。

樣品細(xì)胞色素 b5 含量計(jì)算公式:

1、按照蛋白濃度計(jì)算:

細(xì)胞色素 b5 含量(nmol/mg prot)=(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷( Cpr×V 樣) 

= 0.123×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

細(xì)胞色素 b5 含量(nmol/g 鮮重)=(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×( V 樣總÷V 樣)÷W

= 0.0614×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε: 還原型細(xì)胞色素 b5 納摩爾消光系數(shù)， 171×10^-3 L/nmol/cm; d:  比色皿光徑(cm)， 1cm; V 反總: 反應(yīng)體系總體積， 1.05 m L=0.00105 L; Cpr: 待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)， 需要 另外測(cè)定; V 樣: 加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積，50 μ L=0.05 mL; V 樣總:  待測(cè)液總體積， 0.5 mL; W: 樣品質(zhì)量，g。