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糜蛋白酶（ Chymotrypsin）試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-358

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

糜蛋白酶，又稱胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)。糜蛋白酶的功能與胰蛋白酶相似，但是具有分解能力強(qiáng)、毒性低和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。臨床上糜蛋白酶用于痰液稀化， 對(duì)膿性和非膿性痰液均有效；也用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合，如白內(nèi)障摘除。

測(cè)定原理：

糜蛋白酶催化 ATEE 水解，產(chǎn)物在 237 nm 有特征光吸收；通過(guò)測(cè)定 237 nm  光吸收增加速率，來(lái)計(jì)算糜蛋白酶活性。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑 ×1 瓶 ，4℃避光保存，臨用前加入 50 ml 蒸餾水充分溶解。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì) 、 臺(tái)式離心機(jī) 、水浴鍋 、可調(diào)式移液器 、 1ml 石英比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即粗酶液。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 237 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二置于 37℃水浴中保溫 30min。

3、空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 試劑一 ，1000μL 試劑二，混勻于 237nm 測(cè)定 4min 內(nèi)吸光值 變化，記為△A 空白管 。（從吸光值穩(wěn)定增加開(kāi)始計(jì)時(shí)）

4、測(cè)定管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 粗酶液，1000μL 試劑二，混勻于 237nm 測(cè)定 4min 內(nèi)吸光值 變化，記為△A 測(cè)定管 。（從吸光值穩(wěn)定增加開(kāi)始計(jì)時(shí)）

注意 ：空白管只需要測(cè)定一次。

糜蛋白酶活性計(jì)算公式：

1、按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加 1 為一個(gè)酶活單位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A 測(cè)定管-△A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V1)÷T 

=2.75×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（ml），100μl=0.1 ml； V 反總：反應(yīng)總體積， 1100μl= 1. 1ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min） ，4min。

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加 1 為一個(gè)酶活單位。 

糜蛋白酶（U/g 鮮重）=(△A 測(cè)定管-△A 空白管)×V 反總÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

W：樣品質(zhì)量（ g） ；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（ml） ， 100μl=0.1 ml；V2：粗酶液總體積（ml），1 ml；V 反總：反應(yīng)總體積， 1100μl= 1. 1ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min） ，4min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑配置好后 3 天內(nèi)使用完畢。