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貨號(hào)：LE-1-232

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

PK（EC  2.7.1.40 ）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中， 催化糖酵解過(guò)程中的最 后一步反應(yīng)，是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生 ATP  的關(guān)鍵酶之一，因此測(cè)定 PK 活性具有重要意義。

測(cè)定原理

PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化 NADH 和丙 酮酸生成乳酸和 NAD+，在 340nm 下測(cè)定 NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、 水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存;

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 25μL×2 支，4℃保存；

樣本的前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入 22.5mL 試劑一和 2.65mL 蒸餾水充分溶解， 置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min； 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）試劑三的配制： 臨用前取試劑三一支，加入 1.5mL 蒸餾水充分溶解待用； 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑三和900μL 試劑二，混勻，立即 記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

PK 活性計(jì)算

1、血清（漿）中 PK 活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

PK（nmol/min/mL） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=2613×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=2613×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /g  鮮重） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=2613×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=5.226×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.75×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞總  數(shù)，500 萬(wàn)。