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3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)試劑盒說明書（分光光度法-25管/24樣）

貨號：LE-1-236

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

GAPDH 催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，與糖異生 途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機(jī)體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中 發(fā)揮重要作用。

測定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和 NADH 生成 3 磷酸甘油醛、無機(jī)磷和 NAD ，340nm 處測定 NADH  的減少 量可反映 GADPH 活性的高低。

需自備的儀器和用品

分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。 

提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一 ：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三： 液體 14 μL×1 支 ，4℃保存；

組織樣本的前處理

1、總 GAPDH 酶提?。?/span>建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰  浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃ ,  8000g 離心 10min，取上清測定。 

2、胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離： 按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5～10  的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃ ,  200g 離心 5min， 棄沉淀，取上清在 4℃ ,  8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀  加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴， 200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min）， 然后 4℃ ,  8000g 離心 10min，取上清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。

建議測定總 GAPDH 酶活性，按照步驟 ① 提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 GAPDH，則按照步驟 ② 提取粗酶液。

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體 積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液一），超聲波破 碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在試劑三中加入 500 μL 蒸餾水，充分混勻待用； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁 止反復(fù)凍融。

（3）在 1mL 石英比色皿中加入 30μL 樣本、20μL 試劑三和950μL 工作液，混勻，加入 最后一個試劑的同時開始計(jì)時，記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和  5min20s 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1072×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1072×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每一萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=2.144×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。