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貨號：LE-1-239

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)，催化 1 ，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?nbsp;3-磷酸甘油酸，產(chǎn)生 1 分子 ATP，具有影響 DNA 復制和修補及刺激病毒 RNA 合成等生物學功能，廣泛應(yīng)用于藥物靶標設(shè)計。

測定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油 酸在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 作用下產(chǎn)生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 處的吸 光度變化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計、1 mL 石英比色皿。

試劑組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2.5 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2.5 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 10 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融。

酶液提取

1、總PGK 酶提取：建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴， 200W ，破碎 3s ，間歇 7s ，總時間 1min），然后 4℃ , 500g 離心 5min ，取上清測定。

2、胞漿和葉綠體 PGK 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5～10 的 比例（建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液），冰浴勻漿后于 4℃ , 500g 離心 5min ，棄 沉淀，取上清在4℃ , 8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 PGK 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W ，破碎 3s ，間歇 7s ，總時間 1min），然后4℃ , 500g 離心 5min ，取上清測定葉綠體中PGK 酶活性。

建議測定總  PGK 酶活性，按照步驟 ① 提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 PGK，則按照步驟 ② 提取粗酶液。

測定操作

1、分光光度計預(yù)熱 30min ，調(diào)節(jié)波長至 340nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、取 1mL 石英比色皿，依次加入 500μL 試劑一，100μL 試劑二，50μL 試劑三，50μL 試劑 四，200μL 試劑五，100μL 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2 ，△A=A1-A2

計算公式

1、按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 

PGK（nmol/min /mg prot）= ΔA÷ (ε×d） ×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

PGK（nmol/min /g  鮮重） = ΔA÷ (ε×d） ×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色 皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T ：反應(yīng)時 間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g