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α-酮戊二酸脫氫酶 (α-KGDH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-211

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

α-KGDH（EC 1.2.4.2 ）廣泛存在于動(dòng)物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是三羧酸循 環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一 ，催化 α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶 A。

測(cè)定原理

α-KGDH 催化 α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶 A 生成琥珀酰輔酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示 α-KGDH 活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1mL  石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

試劑一： 50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三： 1mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 55.5mL×1 瓶 ，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，4℃保存；

試劑七：粉劑×1支，4℃保存; 

試劑八：粉劑×1支，4℃保存; 

試劑九：粉劑×1 支，-20℃保存;

試劑十：粉劑×1支， -20℃保存；臨用前加入 2.1mL 蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分 裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶 解待用； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL  試劑三 ，用冰浴 勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 α-KGDH（此步可選做）。

5、在步驟 ④ 的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三 ，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）， 用于線粒體 α-KGDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm 處，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液于37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 試劑十、60μL 樣本和 1.1mL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

α-KGDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1608×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

α-KGDH（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=325×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

α-KGDH  活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總 ÷(ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.65×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1.2×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.06 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2min； Cpr： 樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì) 胞總數(shù)，500 萬(wàn)。