產(chǎn)品名稱:線粒體檸檬酸(MCA)測試盒
產(chǎn)品規(guī)格:25管/24樣,50管/48樣,100管/96樣
產(chǎn)品貨號:LE-1-218,LE-2-218,LE-3-218
免費咨詢:0551-66107970
貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
檢測方法 |
規(guī)格 |
售價(元) |
LE-1-218 |
線粒體檸檬酸(MCA)測試盒 |
分光光度法 |
25管/24樣 |
1500 |
LE-2-218 |
線粒體檸檬酸(MCA)測試盒 |
分光光度法 |
50管/48樣 |
2500 |
LE-3-218 |
線粒體檸檬酸(MCA)測試盒 |
微量法 |
100管/96樣 |
4700 |
線粒體檸檬酸(MCA)含量試劑盒說明書(分光光度法-25管/24樣)
貨號:LE-1-218
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
CA 是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個中間產(chǎn)物,由檸檬酸合酶催化乙酰 CoA 與草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循環(huán)強度的主要指標(biāo)之一。
配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量,其中(1)丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度,(2)綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況,(3)乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和CA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進行狀況。
測定原理:
CA 在檸檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性條件下,α-酮酸進一步與苯肼反應(yīng),生成相應(yīng)的 α-酮酸苯腙; α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰,該波長下吸光度的變化程度可反映出 CA 的含量。
自備儀器和用品:
分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、 1mL 石英比色皿、研缽和蒸餾水。
試劑組成和配制:
酸性提取液:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
堿性提取液: 液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 7.5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 2.5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶, 4℃保存; 臨用前加入 7.5mL 蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存;
標(biāo)準(zhǔn)品:液體 1mL×1 支, 10μmol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。
線粒體中檸檬酸提取:
稱 0.05~0.1g 樣品(建議稱 0.1g 樣本),加入 0.5mL 酸性提取液,冰上充分研磨,600g/min 4℃ 離心 5min;取上清至另一 EP 管中,11000g/min 4℃離心 10min,棄上清(取 300μL 該上清 液和 300 μL 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測定); 沉淀即線粒體, 向沉淀中加 入 0.5mL 酸性提取液,充分懸浮溶解,超聲波破碎(功率 20%, 超聲 3 秒, 間隔 10 秒,重 復(fù) 30 次),取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和,混勻, 置冰上待測(不可用于蛋 白質(zhì)含量測定)。
測定步驟:
1、分光光度計預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長到 330nm,蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。
3、樣本測定:
空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個。
試劑名稱(μL) |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測定管 |
試劑一 |
300 |
300 |
300 |
蒸餾水 |
300 |
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標(biāo)準(zhǔn)液 |
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300 |
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樣本 |
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300 |
試劑二 |
100 |
100 |
100 |
試劑三 |
300 |
300 |
300 |
充分混勻,330nm 立即測定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2,ΔA=A2 –A1。
檸檬酸含量計算:
1、按蛋白濃度計算
檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管) ×V 樣]÷(V 樣÷Cpr)
=10×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管)÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測定。
2、按樣本鮮重計算
檸檬酸含量(μ mol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管) ×V 樣]÷(W×V 樣÷V 樣總)
= 10×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)液濃度, 10μmol/mL; V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積:0.3mL;V 樣總: 加入提取液體積: 1mL;Cpr:樣品蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
注意:最低檢測限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。
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