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線粒體復(fù)合體Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-300

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基 FAD 還原為 FADH₂，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。

測(cè)定原理

復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通過(guò)檢測(cè)2,6-二氯吲哚酚的減少速率來(lái)計(jì)算該酶活性。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑七：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ（此步可選做）。

5、步驟 ④ 中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1） 工作液的配制：臨用前把試劑五和試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑 4℃可保存一周；

（2） 在1mL 玻璃比色皿中加入40μL樣本、100μL試劑七和800μL工作液，立即混勻，記錄 605nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=113×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.4×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴L/mol /cm；

d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。