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線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-305

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

TH 位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為線粒體復(fù)合體六，催化 NADH+NADP⁺ 和 NAD⁺ +NADPH 相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)線粒體 NAD(H)和 NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為 TH-2，催化 NADPH 和 NAD⁺ 生成 NADP⁺ 和NADH。

測(cè)定原理

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致 340nm 吸光 度發(fā)生變化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代 NAD+ ，TH-2 催 化 APAD+還原生成 APADH，APADH 在 375nm 有特征光吸收，測(cè)定 375nm 光吸收的增加速 率，來計(jì)算 TH-2 活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

試劑一： 液體 50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 液體 25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三： 液體 25mL×2 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 支，-20℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①   準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②   將勻漿 600g，4℃離心 5min。

③   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11100g，4℃離心 10min。

④   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 TH-2（此步可選做）。

⑤    步驟 ④ 中的沉淀即為線粒體，加入 500uL 試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于 TH-2 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 375nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1） 工作液的配制： 臨用前取試劑三、試劑四和試劑五各一支，將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑 三中混合溶解 ，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2） 在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 樣本和 1000μL 工作液，混勻，立即記錄 375nm 處初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

TH-2 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmolAPADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T

=164×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmolAPADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2 活性（nmol/min/g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=82×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmolAPADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.164×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1.1×10^-3 L；ε：APADH 摩爾消光系數(shù)，6.7×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，0.5mL；T： 反應(yīng)時(shí)間， 10  min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。