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乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測(cè)試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-333

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑 80mg×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加入 6mL 蒸餾水溶解，-20℃分裝保存；或者按比例現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑三：液體 1mL×1 支，4℃避光保存。

試劑四：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。

試劑五：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

乙醛脫氫酶 (EC 1.2.1.10)是醛脫氫酶的一種，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。在輔酶 I 的存在下，它催化乙醇在內(nèi)的某些一級(jí)或二級(jí)醇、醛或酮的脫氫反應(yīng)。在人類和許多動(dòng)物體內(nèi)，線粒體乙醛脫氫酶能把對(duì)生物體有害的醇類轉(zhuǎn)化，所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關(guān)注；同時(shí)，乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測(cè)方面有較廣泛的研究應(yīng)用。

乙醛脫氫酶催化乙醛和 NAD+轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，利用 NADH 在 340nm 處吸光值的變化即可計(jì)算得到乙醛脫氫酶的活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、液體：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟：

1、紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）預(yù)熱 15min。

3、操作表：

三、ALDH 酶活計(jì)算

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成 1nmol 的 NADH 定義為 1 個(gè)酶活單位。

ALDH 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 804×△A÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣品每分鐘生成 1nmol  的 NADH 定義為 1 個(gè)酶活單位。

ALDH 酶活（U/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 804×△A÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘生成 1nmol 的 NADH 定義為 1 個(gè)酶活單位。

ALDH 酶活（U/10⁴ cell）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷T

= 804×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）

4、按液體體積計(jì)算

酶活定義：每 mL 樣本每分鐘生成 1nmol 的 NADH 定義為 1 個(gè)酶活單位。

ALDH 酶活（U/mL）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反總÷V 樣÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 0.001L；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.2mL；V 樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL， 需自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：1min；10⁹ ：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，其 OD 值不超過 0.3，變化不超過 0.01。

2、△A 大于 1 時(shí)，建議將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)△A 小于 0.01 時(shí)，可以延長反應(yīng)時(shí)間（5min 或 10min）來測(cè)定。

3、試劑五沸點(diǎn)低，在使用時(shí)保持低溫以保證正確的吸取量。